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| 根據國家癌癥中心發布的《2021中國癌癥報告》，2021年，全國惡性腫瘤新發病例數380.4萬例，相當于平均每天超過1萬人被確診為癌癥，每分鐘有7個人被確診為癌癥。 面對逐年增長的癌癥患者數量，腫瘤成為研究學者不斷攻堅的對象，迫切希望找到更好的治療方式。美國的Bruce A. Beutler、盧森堡的Jules A. Hoffmann以及加拿大的Jules A. Hoffmann三位科學家因在免疫學方面的發現獲得2011年諾貝爾生理學或醫學獎，他們革新了我們對免疫系統的認識，為疾病的治療開辟了新的方式。 免疫治療成為對癌癥治療的新型治療手段。其中，CAR-T（Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy）在白血病和淋巴瘤患者身上取得了巨大的臨床成功，導致該領域的研究呈指數級增長。 2021年，國內CAR-T產品上市，標價120萬人民幣。此前國際上已有多款CAR-T的藥物上市，價格也均十分高昂。
CAR-T上市產品這里，小編想給大家分享2021年3月發表于Nature雜志上的一篇影響因子高達53分的文章，接下來小編帶大家一起看看吧。 Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells  本篇文章給大家展示了過去3年中嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞在功效和安全性等方面的主要進展和變化，CAR的各種分子模塊如何影響信號傳導和功能，在CAR-T治療過程中會發生的毒副作用以及如何干預以一定程度的降低毒副作用。 接下來我們一起沿著文章的思路去看看吧。 1、CAR-T的結構 CAR-T治療又稱嵌合抗原受體T細胞治療，是將人的T細胞經過基因工程手段體外修飾改造后，從而可特異性識別和結合腫瘤細胞表面的抗原并實現對腫瘤細胞的特異性殺傷，將其回輸患者體內，用于治療疾病。  圖1 CAR-T細胞治療 （圖1引自The application of CAR-T cell therapy in hematological malignancies: advantages and challenges） CAR-T之所以有這么強大的功能，被用于治療各種疾病，主要在于它的結構。嵌合抗原受體T細胞是抗體的單鏈可變區域（scFv)與T細胞表面受體嵌合于T細胞上，主要由三部分組成，即胞外區、跨膜區和胞內區域。胞外區常為單鏈抗體（scFv)，負責識別并結合靶抗原；跨膜區是鉸鏈或間隔區，可將scFv錨定于細胞膜上；胞內信號域由共刺激因子和CD3信號域組成。當抗原被識別和結合后，產生刺激信號傳至胞內信號域，T細胞被激活并發揮效應功能。  圖2 CAR-T的結構 沒有什么事情是一蹴而就的，CAR-T的結構也是在不斷進步和完善過程中。最早出現的CAR被稱為第一代CAR，僅由一個胞內信號域組成。然而，由于它的結構中缺乏細胞增殖的第二信號，導致由它介導的T細胞特異性結合腫瘤抗原后無法進行進一步的增殖，因此，第一代CAR的抗腫瘤作用很弱，在體內作用時間很短，最終導致T細胞的凋亡。 因此研究人員嘗試設計改造CAR受體，在第一代的基礎上成功設計出第二代CAR，增加了一個共刺激信號的活性結構域。隨著共刺激信號域的加入，T細胞上的第二刺激信號被激活，上游的信號從而被無限擴大，從而促進T細胞的增殖，白介素IL-2的合成和表達，部分抗凋亡蛋白的分泌。也就是說，CART細胞在殺死腫瘤細胞的同時，也實現了其自身的無限擴增。然而卻發現在外源的共刺激信號不存在時，上述作用均無法正常進行。 為了進一步優化CAR的結構，研究人員開始著眼于第三代CAR的開發，在包含胞內信號域、共刺激信號活性結構域的基礎上，增加了額外的共刺激信號。而第三代CAR-T細胞的體內擴增能力、殺傷能力及細胞因子釋放能力均明顯提高。  圖3 第一代至第三代CAR-T （圖3引自Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy） 第一代CAR只有一個激活域，胞外抗原識別區即單鏈可變片段（scFv）融合跨膜區和T細胞受體（TCR）CD3ζ分子胞內信號域組成； 第二代CAR包含一個共刺激域，其衍生自CD28或4-1BB結構域，位于跨膜區和CD3信號傳導域之間； 第三代CAR具有一個激活域和兩個共刺激域。 胞外域由抗體衍生的抗原結合 scFv（單鏈可變片段）與重鏈可變片段 VH 和輕鏈可變片段 VL 組成，它們通過接頭連接。鉸鏈區將 ScFv 與跨膜連接領域。 內域由共刺激域（CD28；CD137 或 4-1BB）和激活域組成：CD3 zeta。 最新的研究表明CAR-T細胞的活性與靶細胞提供的內源性受體也有一定的關系，特別是當它們產生額外的蛋白質分子，如細胞因子，或擁有額外的受體，如共刺激配體時，因此CAR的結構也是在不斷的完善過程中。 那了解了CAR-T的進化史接下來我們一起來看看它的生產過程吧。 2、CAR-T的生產 CAR-T細胞的生產過程包括T細胞的初始分離和富集，CART細胞制備，包括T細胞活化，T細胞擴增，使用病毒或非病毒載體進行CAR載體的基因轉移。病毒載體系統，然后離體CART細胞擴增。最終的細胞產物需要進行后期處理和質量控制測試，測試通過之后進行回輸。 T細胞的初始分離和富集一般是從外周血單核細胞（PBMC）獲得，通常可以采用Ficoll密度梯度離心法用于去除粒細胞，紅細胞和血小板，最終獲得T細胞。 在CART制備過程中T細胞活化和擴增是不可少的步驟。最佳激活應導致足夠的T細胞擴增，而不會引起巨大的T細胞分化或激活誘導的細胞死亡。常見的是使用抗CD3/抗CD28抗體包被的磁珠作為人工抗原呈遞顆粒來激活T細胞。抗CD3抗體可提供強大的增殖信號，而抗CD28抗體則可提供有效的共刺激信號。此外，T細胞通常在 IL-2存在的情況下生長，IL-7和IL-15等細胞因子也被用在T細胞的培養中。在IL-2存在的情況下，離體T細胞的擴增會導致更加分化和疲憊的表型，并且會降低T細胞的持久性。與IL-2相比，IL-7/IL-15的擴增顯示出增強的激活和增殖作用。 擴增好的T細胞需要將相應的遺傳信息轉移到細胞中，CAR構建物通過病毒或非病毒載體轉導入T細胞。逆轉錄病毒和慢病毒載體都被認為是安全有效的，它們都可以隨機整合到宿主T細胞基因組中。用非病毒載體電穿孔細胞是一種成本比較低的基因轉移方法，但安全性和有效性仍在評估中。一些CAR-T細胞的制造現在包括CRISPR Cas9或轉錄激活物樣效應核酸酶(TALENs) 的基因編輯，它可以與腺相關病毒載體結合使用，將CAR-T細胞整合到一個特定的位點。 接下來就是構建好的T細胞在離體的條件下進行擴增然，最終的細胞產物需要進行后期處理和質量控制測試，測試通過之后進行回輸。 3、CAR-T細胞治療的毒副作用 迄今為止，CAR-T細胞免疫療法在白血病和淋巴瘤等血液腫瘤領域取得了重大突破，被認為是最有潛力攻克癌癥的療法之一。2017年FDA先后批準了僅有的兩個CAR-T細胞療法商業產品：諾華的Kymriah（淋巴瘤）與吉利德的Yescarta（白血病），對癌癥的治療帶來了巨大的改變。雖然這種*生物療法可以使某些晚期癌癥患者的病情得到長期緩解，但是相較于同為免疫療法的免疫檢查點抑制劑，阻礙其發展的最大絆腳石就是毒副作用。CAR-T細胞免疫療過程中臨床常見的毒性反應包括細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性（NT）。CAR-T細胞相關毒副反應的發生與多種因素有關，包括CAR結構、培養方式、預處理方案、細胞劑量、腫瘤類型及腫瘤負荷等。 CRS和神經毒性都歸因于分泌細胞因子的T細胞的快速激活和擴張。目前的理解是，CAR - T細胞分泌的細胞因子和/或配體受體相互作用激活骨髓間室的額外免疫細胞，從而釋放更多的細胞因子，創造一個激活炎癥的循環，稱為細胞因子風暴。在病人體內自然產生的腎上腺素也被證明有助于這種自我放大的生產環。盡管神經毒性在臨床上與CRS有關，但其機制似乎不同。 在識別腫瘤抗原后，抗腫瘤反應激活下游嵌合抗原受體T細胞，并激活可分泌炎性細胞因子(如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF和IFNγ)的固有免疫細胞。IL-1和IL-6的釋放導致巨噬細胞中自我放大的炎癥激活循環。促炎細胞因子的增加可能激活了腦血管中的內皮細胞，從而導致該區域通透性增加和毛細血管滲漏(稱為血管源性水腫)，表現為局灶性水腫和神經毒性。最近的一項研究提出的另一種可能的解釋是，腦壁細胞也表達CD19，靶向CAR - T細胞對這些細胞的活性導致了神經毒性。 在這種反應的不同階段進行治療干預可以減輕神經毒性和細胞因子釋放綜合征(CRS)。  Fig4 細胞因子風暴和神經毒性的分子認識和治療干預 識別腫瘤抗原后，嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞下游激活的抗腫瘤反應由于粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、腫瘤壞死因子 (TNF) 和干擾素等炎性細胞因子的分泌而導致先天免疫細胞的激活 -γ（干擾素γ）。 這導致巨噬細胞中的自我放大炎癥激活環導致白細胞介素-1 (IL-1) 和 IL-6 的釋放。 在該反應的不同階段進行治療干預可以減輕神經毒性和細胞因子釋放綜合征 (CRS)。 針對GM-CSF（lenzilumab）、IL-6受體（tocilizumab）和IL-1受體（anakinra）的治療已在臨床上用于此目的。 酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼影響 T 細胞信號傳導以降低 CRS，而甲酪氨酸抑制巨噬細胞炎癥激活以達到類似的效果。 常見的干預措施有： 干預細胞因子，抗體阻斷IL-1、IL-6和GM-CSF，阻斷過度炎癥反應； 控制T細胞的過度激活，采用酪氨酸激酶抑制劑，阻斷激活信號傳導； 化學藥物阻斷細胞因子的過度釋放，采用甲胺酸阻斷兒茶酚胺樣作用。 除毒副作用外，CAR-T治療過程中也會產生抗性的問題，那針對抗性要怎么解決呢，我們一起往下看。 4、CAR-T的耐性和抗性問題 CD19突變的選擇性壓力是抗原丟失最常見的機制，盡管CD19的突變是最常見的，但并不是抗原丟失的記錄機制。有進一步的研究表明，腫瘤細胞來自一個白血病B細胞，該細胞在制造過程中被CAR轉導。CAR分子掩蓋了細胞表面的CD19，阻止了它被CAR - T細胞識別。這個發生的概率雖然很小，但也嚴重影響生產安全。除了CD19的*丟失，Hamieh等人報道了抗原丟失的第三種機制，這解釋了低抗原腫瘤逃逸是如何發生的。通過一種叫做吞噬作用的過程，CARs從腫瘤細胞中移除目標抗原并將其內在化，導致腫瘤細胞上的抗原密度降低。 根據機制的不同可分為抗原依賴性和非抗原依賴性兩方面。對不同原因導致的抗性，文中也提到了不同的解決措施。 （1）抗原依賴性導致原因： 靶抗原丟失（ 指CAR分子能夠從腫瘤細胞上移除目標抗原，并將其內化，降低腫瘤細胞上的抗原密度）； 靶抗原的基因突變導致靶標不能被有效識別； 靶抗原表位被遮蔽。 針對這些情況目前也找到了對應的解決措施： 設計多靶向的CAR分子； 增加靶抗原的表達； 提高scFv與靶抗原的親和力，可能有助于CAR-T細胞識別低密度的靶抗原。 （2）非抗原依賴性導致原因： T細胞表面死亡受體缺失，造成T細胞過度耗竭； 腫瘤細胞表面配體分子缺失，如FAS相關死亡蛋白（FADD）、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體-2（TRAIL-2）的缺失使腫瘤細胞在體外和體內對CAR T細胞更具抵抗作用。 針對非抗原依賴性解決措施： 阻斷免疫抑制檢查點，阻止T細胞耗竭，可修飾CAR-T細胞上的PD-1分子，在細胞表面表達PD-1的顯性負性受體或采用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除T細胞上PD-1的基因； 提高CAR-T細胞的增殖能力、持久性和抗瘤活性，可在CAR-T細胞上表達IL-7受體； 改變T細胞終末狀態的分化，研究表明過表達c-Jun AP1轉錄因子可以降低T細胞耗竭。 在CAR - T細胞治療領域的大多數經驗是在血液系統惡性腫瘤的環境中，腫瘤微環境(TME)被認為在反應中發揮的作用微乎其微。然而，隨著該領域從靶向cd19的CAR-T細胞轉向實體腫瘤，抑制TME也可能產生對CAR - T細胞治療的耐藥性。這對于難以穿透、高度免疫抑制的實體惡性腫瘤，如膠質母細胞瘤或胰腺癌等來說值得倍加關注。缺乏趨化因子來吸引CAR-T細胞，不正常的血管系統和細胞外基質產生的癌癥相關成纖維細胞都使得CAR - T細胞難以進入腫瘤。一旦出現這種情況，免疫抑制細胞和細胞因子，包括Treg細胞、骨髓來源抑制性細胞（MDSC）、TGFβ、IL-6、IL-10和前列腺素e2都會抑制CAR - T細胞的增殖和效應功能。 針對這種情況目前可以通過一下兩種方法解決： （1）增強CAR-T細胞的浸潤能力，可過表達IL-7和CCL-19； （2）改變Treg介導免疫抑制作用。  圖5 抗原依賴性和抗原非依賴性抗性機制 對嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞療法的抗性可根據抗原丟失或保留的情況進行分類。抗原丟失最常見的原因是編碼抗原本身的基因發生突變。然而，由于腫瘤細胞的意外轉導導致腫瘤抗原的“CAR掩蔽”，導致抗原丟失，從而導致復發。此外，腫瘤抗原水平降低可能導致復發，這可能是由于吞噬作用，其中T細胞上的CAR分子從表面去除腫瘤抗原，將其內化并開始自身表達腫瘤抗原。抗原非依賴性抗性是由于T細胞耗盡。這可能是由于具有終末效應表型的次優輸注產品、腫瘤細胞上的死亡受體信號丟失使其對 CAR T 細胞殺傷具有抗性，或者由于 CD4+CD25+ 調節性 T 細胞（Treg 細胞）和骨髓衍生的免疫抑制性腫瘤微環境所致抑制細胞（MDSC）及其各自的可溶性因子。 5、CAR-T的研究進展 （1）新的治療靶點和治療產品 經過不斷的技術改進和嚴格的臨床監護管理目前已經可以有效的控制CAR-T的副反應，CAR-T療法治療癌癥的數量逐漸增多；CAR-T在白血病、淋巴瘤等血液類疾病中臨床表現良好，但在血液腫瘤相關領域靶點扎堆的現狀也是需要突破的瓶頸之一。目前針對多發骨髓瘤也有了GPRC5D（G蛋白偶聯受體）、CD38、CD138、SLAMF7等新靶點，腦瘤有了氯毒素肽、EGFRvIII、HER2等靶點的突破。 此外，某些特定T細胞亞群修飾的CAR-T細胞可能會產生較好的效果。目前，CAR-T的生產是使用來自患者的異質T細胞(CD4 + T細胞和CD8 + T細胞在某些情況下除外)。然而，有研究表明，某些T細胞亞群可能效果更好。臨床試驗中已經使用了中心記憶T細胞生產基于CD28的CD19靶向的CAR T細胞。初步結果表明，這些細胞是有效的，雖然與批量生產的CD19靶向的CAR - T細胞相比不一定具有持久性。 與此同時，CD26高表達的CAR-T細胞也在進一步研究中，由于其能夠產生IL-17A、IFN-γ、IL-2和IL-22，細胞表面表達CCR2和CCR5，具記憶干細胞樣特性，它們在實體腫瘤模型中有*的功能。 γδ T細胞是另一個潛在的有利亞群。γδT細胞能耐受T細胞耗竭，其表面抑制性受體（TIM3和PD-1）表達水平較低，同時表達共刺激和抗原呈遞分子（CD86 和人類白細胞抗原-DR (HLA-DR)），并已被證明可將腫瘤抗原交叉呈遞給TME中的其他 T 細胞。  圖6 細胞亞群的選擇 與傳統的CAR T細胞相比，CD26高表達的CAR T細胞增加了細胞因子的產生，更類似于干細胞的表型和較強的細胞運輸能力。 與傳統的CAR T細胞產品相比，具有內源性γδ T細胞受體的CAR T細胞耗竭減少，共刺激增加。 （2）通用型細胞治療 結合各種情況看通用型細胞治療是未來發展的方向，其主要難點是GvHD宿主抗移植物反應。宿主抗移植物反應與TCR上HLA基因相關。通用的CAR細胞治療，一種思路是編輯修飾相關基因，如TALEN基因編輯的TCR-α基因或者CRISPR-Cas9基因編輯敲除TCR上的HLA基因；另一種思路是設計CAR分子，zipper-CAR系統通過zipper蛋白的受體和配體橋接scFv和CAR分子胞內結構，通過更換不同的scFv設計靶向多抗原的通用CAR。  圖7 通用型CAR-T系統 單鏈可變片段 (scFvs) 可以切換以同時靶向新抗原或多個抗原，并且可以改變拉鏈結合親和力以調整CAR信號的強度以獲得適當的反應。門控策略也可以通過在不同的分子上具有CD3ζ信號域和共刺激域來使用，因此兩個相應的抗原都必須存在才能具有*的CAR激活。 （3）CAR-X細胞 CAR-T細胞療法陸續面世的同時，關于CAR-T的討論也開始轉向更加充滿想象空間的“CAR-X”新型細胞療法，包括CAR-巨噬細胞（CAR-M）療法、CAR-自然殺傷（NK）療法、CAR-Treg細胞療法、 CAR γδ-T細胞療法等。  圖8 新型CAR細胞設計 CAR-NK細胞：NK細胞是自然殺傷細胞，具有天然的抗腫瘤作用。其優點是無MHC限制性，安全性較高，可制備同種異體細胞，CAR-NK是通用型細胞治療一個比較好的選擇。臍帶血CAR-NK細胞在體外具有細胞毒性，在體內具有持久性和抗腫瘤作用。關于毒性，這些CAR-NK細胞具有化學誘導的caspase 9基因，可以通過體內治療消除。 CAR-Ms巨噬細胞：巨噬細胞具有抗原特異性吞噬和促炎極化作用，能交叉遞呈抗原并激活T細胞。研究表明，CAR-M巨噬細胞在小鼠肺癌轉移模型中展示了較強的抗腫瘤活性。在人源化小鼠中，CAR-Ms增強了T細胞抗腫瘤反應，單細胞RNA測序表明其誘導了促炎性腫瘤微環境。 CAR-Treg細胞：CD4 + CD25 +調節性T細胞(Treg細胞)能夠分泌免疫抑制分子TGFβ, IL -10, IL-35，可用于治療自身免疫性疾病和移植的排斥反應，也可防止T細胞過度激活。可作為自身免疫性疾病和移植的潛在療法。 CAR-T細胞研究之前迅速進入臨床，因其可能產生的副作用又回到了試驗臺，試驗結果提供了新的功效、毒性和耐藥性機制，并促進了對新靶點的探索，信號機制的闡明和新技術的應用發展。在CAR分子設計、轉導方法和選擇最佳細胞類型方面的創新可能會帶來新的突破，改變未來對許多不同腫瘤的治療方式，細胞治療方式未來可期。 最后小編給大家做好了整個CAR-T流程的梳理以及整個過程中會用到的產品，有需要的老師可以隨時聯系愛必信哦！  Absin提供相關科研試劑，全部現貨，可提供大包裝，助力您的CAR-T研究！
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