一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、動(dòng)物：新生 1–3d SD 大鼠乳鼠全腦（含皮質(zhì)、海馬、紋狀體）。

2、主要試劑

• DMEM（abs9483）

• 胎牛血清（abs972）

• 雙抗（abs9244）

• 0.25 % 胰蛋白酶-EDTA（abs47014938）

• 組織解離液（abs9482）

• 10xPBS（abs961）

• 1xPBS（abs962）

• Percoll（abs9102）

• 70um 細(xì)胞篩網(wǎng)（abs7232）

• 細(xì)胞培養(yǎng)皿（35mm）（abs7004）

• 細(xì)胞培養(yǎng)皿（60mm）（abs7005）

二、小膠質(zhì)細(xì)胞提取與分選

1、酶消化

（1）將腦組織剪碎成 0.5-1mm³ 的小組織塊，將組織塊（100-200mg）轉(zhuǎn)移到 2mL圓底管中，加入1mL 消化液（cat: abs9482），37℃水平搖床 80rpm 的速度輕輕搖動(dòng)孵育30-40min（根據(jù)組織糜爛狀態(tài)適當(dāng)延長時(shí)間）

（2）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋管 10-20s，通過 70um 細(xì)胞篩網(wǎng)（cat: abs7232）過濾，用 10mL PBS 沖洗細(xì)胞篩網(wǎng);

（3）收集含有細(xì)胞的濾液到 50mL 管中，20℃下400g離心5min，棄上清。

2、Percoll 密度梯度純化

（1）30% Percoll 溶液

Percoll 細(xì)胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液。

用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 3:7 混合，配制 30%等滲 Percoll 溶液。

（2）37% Percoll 溶液

Perco11 細(xì)胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 37:63混合，配制 37%等滲 Percoll 溶液

（3）70% Percoll 溶液

Perco11 細(xì)胞分離液與 PBS 緩沖液(10x)按體積比 9:1 混合，配制等滲 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按體積比 7:3混合，配制 70%等滲 Percoll 溶液；

（4）吸取 4 mL 70% percoll 深入 到 15mL 離心管底部；

（5）用 4mL，37%percoll （cat: abs9102）重懸細(xì)胞沉淀，沿著管壁緩慢加入含4mL 50% percoll 離心管中，覆蓋在 70% Percol 溶液的頂部形成密度梯度；

▲注意：不要破壞 37% Percoll和 70% Percoll 與細(xì)胞的懸液的分界面，37%和 70% percoll 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（6）吸取 4mL 30% percoll，沿著管壁緩慢15mL 離心管中，覆蓋在 37% Percoll細(xì)胞溶液的頂部形成密度梯度；

（7）900xg，20℃，離心 45min，升速(ACC)1，降速(DEC)1；

（8）離心結(jié)束后，吸取中間 37% 與70% Percoll界面層細(xì)胞（富含 TC）至新的 15mL 離心管中，加入3倍體積 4℃預(yù)冷 1xPBS，上下顛倒混勻， 4℃下 400g離心 5min，棄上清；

（9）按照步驟（8）重復(fù)清洗一次，棄上清得到細(xì)胞。

三、培養(yǎng)與傳代

（1）培養(yǎng)基：DMEM + 10% FBS + 1% 雙抗。

（2）每 2–3 天換液；細(xì)胞長至 80% 匯合時(shí)，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1–2min，1:3傳代。

（3）前 3 代以內(nèi)功能較穩(wěn)定，建議實(shí)驗(yàn)在此窗口內(nèi)完成。

四、注意事項(xiàng)

1、消化時(shí)間勿超 90min，以免降低活率。

2、Percoll 離心后收細(xì)胞時(shí)，界面層需精準(zhǔn)吸取，避免混入紅細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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