過(guò)去十年，靶向蛋白降解（TPD）從實(shí)驗(yàn)室寵兒躍升為千億級(jí)產(chǎn)業(yè)，Cereblon（CRBN）作為較常用的 E3 酶之一，其配體親和力數(shù)據(jù)直接決定 PROTAC 分子的活性窗口。然而，一個(gè)被忽視的技術(shù)細(xì)節(jié)——示蹤劑（tracer）的標(biāo)記方式——正悄悄拉大我們與真實(shí)客觀數(shù)值的距離。

進(jìn)口R品牌的高通量CRBN Binding Kit 用“沙利度胺-熒光蛋白"作為示蹤劑，在行業(yè)內(nèi)先建立了高通量篩選范式，這一方案如今被我們重新拆解、驗(yàn)證、升級(jí)。它不是簡(jiǎn)單的“國(guó)產(chǎn)替代"，而是對(duì)實(shí)驗(yàn)失真問(wèn)題的系統(tǒng)性修復(fù)，讓IC50更加接近客觀真值。

失真源頭：當(dāng) 105 kDa 的 APC 蛋白騎在 0.25 kDa 的沙利度胺頭上

XL665作為第一代acceptor，是改良過(guò)的別藻藍(lán)蛋白（APC），將 APC的亞基偶聯(lián)，增加了穩(wěn)定性，位于紅外光區(qū)，激發(fā)波長(zhǎng) 620nm，發(fā)射波長(zhǎng)665nm，進(jìn)一步降低了生物溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響（生物學(xué)成分很少在紅外光區(qū)有自發(fā)熒光），XL665作為acceptor在CRBN Binding中使用，分子量約為105 kDa，但是與沙利度胺偶聯(lián)后，對(duì)體系有以下影響：

空間位阻：

? APC/XL665 的直徑≈6nm，相當(dāng)于沙利度胺長(zhǎng)度的 10 倍，在 CRBN 淺口袋入口形成“熒光墻"；
? 大分子熒光標(biāo)記會(huì)在 CRBN 淺口袋入口處產(chǎn)生空間位阻，導(dǎo)致表觀 K_d 被系統(tǒng)性高估 1.5–4 倍。

擴(kuò)散速率：

? 蛋白示蹤劑整體分子量高，擴(kuò)散系數(shù) D 下降 ；
? 小分子候選物（< 0.5 kDa）擴(kuò)散系數(shù)遠(yuǎn)高于kit中標(biāo)記后的沙利度胺，競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境失衡。

結(jié)果失真：

? 以上這些影響因素導(dǎo)致IC50數(shù)值與結(jié)果存在偏差，影響候選物的選擇

技術(shù)破局：把小分子還給小分子

用分子量小于1kDa的小分子熒光團(tuán)直接標(biāo)記沙利度胺，從物理層面消除兩大失真因子，競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)回到“小分子對(duì)小分子"的公平賽道，讓每一次 IC50都經(jīng)得起臨床拷問(wèn)。

數(shù)據(jù)說(shuō)話

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖表可知，由于Thalidomide標(biāo)準(zhǔn)品與Thalidomide-Ac競(jìng)爭(zhēng)與CRBN/DDB1的結(jié)合，使信號(hào)值降低。

（2）結(jié)合活性和抑制劑驗(yàn)證*

Thalidomide-Ac與CRBN/DDB1結(jié)合驗(yàn)證，由結(jié)果可知，蛋白濃度不變時(shí)，檢測(cè)信號(hào)隨著Thalidomide-Ac濃度的升高而增加。Lenalidomide和Pomalidomide以及PROTAC BET Degrader-1可以競(jìng)爭(zhēng)Thalidomide-Ac與CRBN/DDB1的結(jié)合。

*數(shù)據(jù)僅做示例參考

不止于 CRBN，更有 PROTAC的“一站式解決方案"

? 基于TR-FRET的三元復(fù)合物篩選

? PROTAC藥靶蛋白

? PROTAC分子——陽(yáng)性對(duì)照

? PROTAC靶點(diǎn)相關(guān)抗體

TPD 的黃金時(shí)代已經(jīng)到來(lái)，但黃金也需要準(zhǔn)確的刻度。我們相信，真實(shí)的數(shù)據(jù)是創(chuàng)新最大的加速器。當(dāng)示蹤劑的分子量回到小于1kDa，我們不僅修復(fù)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，更為整個(gè)行業(yè)節(jié)省了大量時(shí)間、資本與試錯(cuò)的生命。

好消息！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)！

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...