多巴胺神經元能表達人腦多巴胺神經元的特異性標志物（如 TH、DAT、GIRK2 等），適用于體外研究。今天小愛帶大家了解一下hPSC誘導分化多巴胺神經元具體流程。以6孔板的2個孔hPSC分化為例，最終可獲得 6 個孔的成熟多巴胺神經元（至少 1.2×10^7個細胞）。

一、誘導材料準備

1、所需試劑

hPSC誘導分化多巴胺神經元試劑盒（abs90320-1kit）

產品組分

注：括號內容如50×為母液濃度，使用時終濃度需為1×。例如補充劑A（50×）和補充劑（10×）需添加進基礎培養基1使其分別稀釋50倍以及10倍，使得補充劑終濃度為1×，配成mNPC誘導培養基（0-2）。包被液1濃度250 U/mL表示每毫升有250個單位的包被蛋白，在本方案中鋪板時，每平方厘米需要2個單位的包被蛋白。

2、需自備試劑與耗材：

試劑：

（1）H9人胚胎干細胞（無飼養層）（abs9412）；

（2）Advance 人多能干細胞培養基（abs9404）；

（3）Y-27632（abs812864）；

（4）DMEM/F12（abs9560）；

（5）細胞消化液（干細胞級別）（Accutase）（abs47014935）；

（6）ES/iPS細胞凍存液（abs9412）；

（7）PBS（abs962）；

耗材：

（1）細胞培養板（標準透明6孔板）（abs7033）

（2）細胞培養板（標準透明12孔板）（abs7034）

（3）細胞培養板（標準透明24孔板）（abs7035）

（4）10mL一次性移液管（abs7053）

（5）25mL一次性移液管（abs7054）

（6）2mL內旋凍存管（abs7164）

二、誘導分化流程圖

hPSC：人多能干細胞；mNPC：中腦神經祖細胞；mDA：中腦多巴胺神經元；

三、實驗內容與方法（以 hESC H1 及 6 孔板 1 個孔為例）

1、試劑準備：

（1）在 4℃解凍 補充劑 A、B、C、D、E，不要在 37℃條件下解凍。

（2）在生物安全柜中，參照“產品組成“及“試劑準備"，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養基 。例如 mNPC 誘導培養基（0-2）組成為基礎培養基 1、1×濃度的補充劑 A、B，若用量為 10mL，配制方法為 8.8 mL 基礎培養基 1+200μL 補充劑 A（50×）+1 mL 補充劑 B（10×）。

（3）分化培養基建議現配現用，置于 4℃儲存，2 周內使用。

注：補充劑 B 使用時盡量避光，且所有補充劑可根據使用量進行分裝以避免反復凍融。

2、hESC 培養和準備:（詳見Advance 人多能干細胞培養基（abs9404）使用說明書）

3、DAY0-9: hESC 分化為中腦神經祖細胞（mNPC）

（1）包被液 1 和 2 在 4℃下解凍，與 DMEM/F12 均勻混合，按 2 U/cm2的包被密度鋪板，備用。

（2）DAY0：當hESC的匯合度達到75%-85%，吸去培養基，用2mL 1×室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)  清洗 hESC，吸去 PBS。

（3）加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉移到 37℃ 5% CO2細胞培養箱中5min，使其解離成單細胞。

（4）3-5min 后，將干細胞傳代培養基以等體積直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。

（5）從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。

（6）離心結束，充分去除上清，將 1 mL 預熱的 mNPC 誘導培養基（0-2）（成分為：基礎培養基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 B）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。

（7）使用自動細胞計數器計數細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞，將細胞接種到步驟 1 制備的包被板上使得最終密度為 6-8×104個細胞/cm2，在 6 孔板中每孔最終體積為 2 mL（含 10μM Y-27632），將孔板轉移到 37℃、5%CO2 細胞培養箱中孵育 48 h（若 24 h 后培養基變黃則及時用含 10μM Y-27632 的 mNPC 誘導培養基換液(0-2)）。

（8）DAY2：使用 mNPC 誘導培養基（2-7）換液（成分為：基礎培養基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 C），直到第 7 天。

（9）DAY7：使用 mNPC 誘導培養基（7-9）換液（成分為：基礎培養基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 D），培養至第 9 天。可取第 9 天的細胞進行免疫熒光染色檢測 NPC 標志物如 SOX2、Nestin，中腦標志物 FOXA2。 
注：包被液使用時需在冰上操作，所有與包被液直接接觸的物品需提前預冷。包被液鋪板后盡量于 1 周內使用，使用前需至于室溫 1h 或 37℃培養箱孵育 30 分鐘以上，以恢復至室溫。

4、DAY9-23: mNPC 誘導分化為中腦多巴胺神經元(mDA)

（1）DAY9： 第 9 天，從培養物中抽吸培養基，在 6 孔板中每孔用 2 mL 1×室溫 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養物，然后從孔中移除 PBS。

（2）加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉移到 37℃ 5% CO2 細胞培養箱中3-5min，使其解離成單細胞。

（3）3-5min 后，將 DMEM/F12（含 10μM Y-27632）以等體積直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。

（4）從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。

（5）離心結束，充分去除上清，將適量預熱的 mDA 誘導培養基（成分為：基礎培養基 1，1 ×補充劑 A）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。按 1：3 比例接種在包被液 1 包被的板中，每孔加入 2 mL 細胞懸液于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養24h 。

（6）DAY11: 第 11 天開始根據培養基顏色每天或隔天更換一次 mDA 誘導培養基，直到第 23 天。

注：D23 天的 mDA 可用無血清細胞凍存液plus（abs9478）在液氮中冷凍。

5、DAY 23-40: mDA 成熟階段 

（1）DAY23: 第 23 天，從培養物中抽吸培養基，在6 孔板中每孔用 2mL 1×室溫 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養物，吸去 PBS。

（2）每孔加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，將培養物置于 37℃ 5%CO2細胞培養箱中孵育 5 min。

（3）5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12（含 10μM Y-27632），輕輕吹打細胞，使其脫離孔底。

（4）將細胞懸液收集到 15 mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。

（5）仔細抽吸上清液，不干擾細胞，用 1mL 恢復室溫的 mDA 成熟培養基（成分為：基礎培養基 2，1×補充劑 E）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。

（6）使用臺盼藍排除死亡細胞，自動細胞計數器計數細胞，將細胞接種到提前制備的包被液 2 包被的 6 孔板上使得密度為 6-8×105個細胞/cm2 ，根據培養基顏色每天或隔天換液，直到第 25 天。

（7）DAY25: 更換為不含 Y-27632 的 mDA 成熟培養基。根據培養基顏色每天或隔天換液，直到第 40 天。

（8）第 40 天可檢測到神經元標志物（MAP2），多巴胺神經元標志物（TH、DAT、GIRK2）的表達。

注：由于細胞密度較高，注意及時換液。

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