92 kDa gelatinase, 92 kDa type IV collagenase, CLG4B, EC 3.4.24, EC 3.4.24.35, Gelatinase B, GELB, macrophage gelatinase, MANDP2, matrix metallopeptidase 9, matrix metalloproteinase 9, matrix metalloproteinase-9, MMP9, MMP-9, type V collagenase

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術。特異性抗人MMP-9抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的MMP-9與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品搜集及儲存
①細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2000pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（2000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。


二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準確度可能會受影響；
13. 計算結(jié)果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標準曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應根據(jù)同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Human MMP-9， 測定其回收率。 回收率范圍在85-104%，平均回收率在97%。 
2. 靈敏度：Human MMP-9的zui低可測劑量（MDD）一般在0.156ng/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此 ELISA 試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達的高純度重組Human MMP-9蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Human MMP-9，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。

5. 特異性：此 ELISA 法可檢測天然及重組人分子量為92kDa MMP-9 蛋白原肽及 82kDa 激活形式的 MMP-9 蛋白，不能測定分子量為 65kDa 的 MMP-9 蛋白。將以下因子用稀釋劑(1×) 配置成 100ng/mL或 200ng/mL 的濃度來檢測與Human MMP-9 的交叉反應。將 200ng/mL 的干擾因子摻入中間范圍的重組Human MMP-9 對照品中，來檢測對Human MMP-9 的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。



四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）也被稱為matrixins，是鋅鈣依賴性蛋白水解酶家族成員，可分解細胞外基質(zhì)（ECM），在不同的亞細胞環(huán)境中，參與多種分子的加工過程。MMPs在眾多生理學進程中發(fā)揮重要功能，例如胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、繁殖以及組織重構(gòu)。也參與炎癥以及自身免疫疾病，例如關節(jié)炎、癌癥和心血管疾病。新合成的MMPs的量主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)節(jié)，已經(jīng)存在的MMPs的蛋白水解活性，不僅受控于酶原的活性，也受控于內(nèi)源性抑制劑對酶活性的抑制，例如α2-巨球蛋白，以及金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）。
MMP-9（也稱明膠酶B、92kDaIV型膠原酶、92kDa明膠酶、V型膠原酶）作為糖基化酶原被分泌出來。酶原的活化涉及到N-末端前體區(qū)域的蛋白水解去除，最終形成82kDa的活性酶。活性人MMP-9與小鼠和大鼠的MMP-9分別有72%和74%的氨基酸序列同源性。除了鋅結(jié)合位點，催化結(jié)構(gòu)域還包含三個連續(xù)的纖連蛋白II型同源單位，可結(jié)合明膠。富含脯氨suan的鉸鏈區(qū)將催化結(jié)構(gòu)域連接到C-末端血紅素樣結(jié)構(gòu)域。在體外實驗中，酶原經(jīng)4-氨基苯基乙酸乙酯（APMA）處理后，不僅能產(chǎn)生活性酶，還能產(chǎn)生活性與其相當?shù)腃-末端截短形式。MMP-9可降解ECM中的成分，尤其對變性膠原（明膠）有非常高的特異性。MMP-9也可裂解III、IV、V、XI型膠原，以及彈性蛋白、巢蛋白-1和玻連蛋白。MMP-9還可裂解多種趨化因子和生長因子（例如IL-1β、CXCL8/IL-8、CXCL7、CXCL4、CXCL1、LatentTGF-β、膜結(jié)合TNF-α、VEGF和FGFbasic），β-淀粉樣蛋白、P物質(zhì)、髓鞘堿性蛋白。此動作可提高或降低這些可溶性因子的生物活性，也可使它們從與ECM的聯(lián)合中被釋放出來。MMP-9也可通過各種各樣的膜蛋白觸發(fā)信號通路，或是誘導它們從細胞膜上脫落從而抑制信號通路（例如CD44，E-鈣黏蛋白、整合素、ICAM-1和IL-2Rα）。
MMP-9由多種正常細胞和轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生，包括中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、星形膠質(zhì)細胞、纖維原細胞、破骨細胞、軟骨細胞、角化細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞。它影響生理性和病理性的血管生成和血管重構(gòu)。活化的中性粒細胞釋放MMP-9前體，不結(jié)合TIMP-1，允許促血管生成的FGF-2從ECM中釋放出來。MMP-9和TIMP-1的復合物不能誘導FGF-2的釋放。中性粒細胞來源的MMP-9可加劇炎癥反應，通過產(chǎn)生來自膠原多肽來誘導額外的中性粒細胞MMP-9的釋放。MMP-9在骨形成和重構(gòu)、jia基苯丙an誘導行為敏化與應答、神經(jīng)元突觸重構(gòu)的調(diào)控、著床過程中的滋養(yǎng)層入侵、絲氨suan蛋白酶抑制劑α1的活化中也發(fā)揮重要作用。MMP-9介導的粘附分子的脫落對于腫瘤細胞的侵襲也有直接作用。
MMP-9的循環(huán)水平在許多炎癥失調(diào)疾病中有所升高，包括管腔內(nèi)血栓的形成、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病、丙型肝炎病毒感染、結(jié)腸直腸癌以及杜氏肌營養(yǎng)不良。MMP-9與TIMP-1的比例在多發(fā)性硬化癥血清和囊性纖維化痰中升高，但在巨細胞病毒感染的血清中降低。游離MMP-9的水平、MMP-9與脂質(zhì)運載蛋白-2/NGAL復合物的水平分別在卵巢癌患者、子宮尿道感染患者的尿液中升高。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

1. 請在試劑盒有效期內(nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。