本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有人白細胞介素13(IL-13)捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生wu素標記的檢測抗體，HRP酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣本中的人白細胞介素13(IL-13)呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣本濃度。

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3.12-200pg/mL

1.17pg/mL

一、實驗所需自備試驗器材：
1、酶標儀（450nm）
2、高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、5-50uL、20-200uL、200-1000uL
3、37℃恒溫箱
4、蒸餾水或去離子水

二、樣本處理及要求：
試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關文獻預估樣本中待測物的濃度并通過預實驗確定樣本的實際濃度。如果樣本中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當的稀釋或濃縮。
若所檢樣本不在說明書所列樣本類型之中，建議做預實驗驗證其檢測有效性。
血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或2-8℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
組織勻漿：用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響檢測結果），稱重后將組織jian碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
細胞裂解液：貼壁細胞用預冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白mei消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預冷PBS清洗3次，每1×10^6個細胞中加入150-200μLPBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當減少PBS體積）并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
其它生物樣本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
樣本外觀：樣本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
樣本保存：樣本收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，樣本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血樣本不宜進行此項檢測。

三、樣本稀釋方案：
請提前預估樣本的濃度范圍，如果您的檢測樣本需要稀釋，參考稀釋方案如下：
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL通用稀釋液內，做100倍稀釋；
稀釋1000倍：兩步稀釋。取5μL樣本到95μL通用稀釋液內，做20倍稀釋，再取5μL20倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，總共稀釋1000 倍；
稀釋100000 倍：三步稀釋。取5μL樣本到195μL通用稀釋液內，做40倍稀釋，再取5μL40倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，最后取5μL 2000 倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，總共稀釋100000倍；
每步稀釋時取液量不少于3μL，稀釋倍數不超過100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。

四、檢測前準備工作：
1、請提qian 10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2、標準品梯度工作液配制：加入 1mL 通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其wan全溶解后輕輕混勻(濃度為200pg/mL)，然后按照以下濃度：200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL、0pg/mL進行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL 的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL 的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數第二管中吸取液體，具體如下圖。
3、生wu素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮生wu素化檢抗于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生wu素化檢抗稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，現配現用。
4、酶結合物工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮酶結合物稀釋成1×工作濃度(例：10 μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，現配現用。
5、1×洗滌液配制：取10mL20×洗滌液到190mL蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可放置室溫，待結晶wan全溶解后再配制)。

五、操作步驟：
1、從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2、加樣：分別將樣本或不同濃度標準品按照100μL每孔加入相應孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：將待測樣本用通用稀釋液zui低稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。
3、加生wu素化檢抗：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入100μL生wu素化檢抗工作液，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。
4、洗板：棄去液體，每孔加入300μL1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。
5、加酶結合物工作液：每孔加入100μL酶結合物工作液，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。
6、洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。
7、加底物：每孔加入90μL底物(TMB)，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
8、加終止液：取出酶標板，每孔直接加入50μL終止液，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

六、實驗結果計算：
結果判斷：
1、計算標準品和樣本復孔的平均 OD值并減去空白孔的 OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標 ，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線。
2、若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
七、試劑盒性能：
1、重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
2、回收率：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入3個不同濃度水平的人IL-13，計算回收率。
3、線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入高濃度人IL-13，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。

白細胞介素-13（IL-13）是由位于5號染色體上的IL13基因表達的。IL-13是一個132個氨基酸的蛋白質，含有一個擬議的20個氨基酸的信號肽，與人類IL-4有大約30%的氨基酸序列同源性。此外，這兩種細胞因子表現出重疊的生物活性。人的IL-13是由激活的Th0、Th1類Th2類和CD8T細胞產生。與 IL-4相似，IL-13對單核細胞/巨噬細胞的分化和功能有多種影響。IL-13可以 抑制單核細胞/巨噬細胞的細胞毒性功能。

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未開封試劑盒，4°C儲存，有效期6個月。

1、嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃。使用后立即冷藏試劑。
2、洗板不正確可能導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。整個過程中不要讓微孔干燥時間過長。
3、清潔板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。
4、底物顯色液應呈無色的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
5、避免試劑和樣本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中試劑的生物活性。
8、不能使用過期產品，不同貨號和批號組分不得混用。
9、試劑盒以外來源的重組蛋白可能會出現與本試劑盒抗體不匹配而不被識別的情況。
10、如果可能傳播疾病，所有的樣本都應管理好，按照規定的程序處理樣本和檢測裝置。