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Mouse IL-6 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測技術。特異性抗小鼠IL-6抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經過孵育，樣本中存在的IL-6與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Mouse

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品搜集及儲存
①細胞培養上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據樣本稀釋倍數，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為1000pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（1000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內加入100uL SA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變為黃色。如果溶液顏色變為綠色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
注：提供的標準曲線數據僅供參考，應根據同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數
1. 回收率：在細胞培養基樣本中摻入不同水平的Mouse IL-6，測定其回收率。回收率范圍在70-114%，平均回收率在91%。
2. 靈敏度：Mouse IL-6的可測劑量（MDD）一般小于1.8pg/mL。可測值是根據20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經大腸桿菌表達的高純度重組Mouse IL-6蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Mouse IL-6，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Mouse IL-6蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與Mouse IL-6的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Mouse IL-6對照品中，來檢測對Mouse IL-6的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。


四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）




五、實驗流程圖

白細胞介素-6（IL-6）是一個具有α螺旋結構，22-28kD的磷酸化和不同程度糖基化的多功能細胞因子，它在疾病急性期反應、炎癥、造血、骨代謝以及癌癥惡化等方面起重要作用。成熟的小鼠IL-6有187個氨基酸，與人和大鼠IL-6分別有42%和85%同源性。IL-6內部的選擇性剪接而產生多種異構體，有些剪接體表現出拮抗特性。已知表達IL-6的細胞，包括CD8+T細胞、成纖維細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、成骨細胞、巨核細胞、內皮細胞（在內皮素的影響下）、交感神經元、大腦皮質神經細胞、腎上腺髓質嗜鉻細胞、視網膜色素細胞、肥大細胞、角質形成細胞、朗格漢斯細胞、胎兒及成人星形膠質細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞，結腸上皮細胞、B1B細胞和胰島β細胞。IL-6的產生通常是在糖皮質激素、兒茶酚胺和第二性類固醇的控制下，一般與細胞激活相關。正常人血液中的IL-6在1pg/mL范圍內，在月經期略有升高、在某些癌癥的中晚期中度增高、在大型手術后有顯著升高。
IL-6通過細胞表面受體引發細胞信號，該受體是由配體結合亞單位（IL-6受體）和信號轉導亞單位gp130組成的異二聚體復合物。IL-6結合到IL-6受體上，引發了IL-6受體與gp130的結合及gp130的二聚體化。gp130也是CLC、CNTF、CT-1、IL-11、IL-27、LIF和OSM受體的組成部分。可溶性IL-6受體是由選擇性剪接和蛋白酶切割產生的。通過反式信號轉導機制，可溶性IL-6和IL-6受體復合可引發表面缺乏IL-6受體，但表達gp130細胞的應答。IL-6受體的表達主要局限于肝細胞、單核細胞、淋巴細胞和靜息淋巴細胞，由于gp130分子表達非常廣泛，反式信號轉導實現了更廣泛的細胞類型對IL-6的響應。可溶性gp130剪接體阻止了IL-6/IL-6R的反式信號轉導，但不能阻止其它細胞因子利用gp130分子作為共同受體的信號轉導。
IL-6與腫瘤壞死因子α（TNF-α）和IL-1一道，所引起的急性炎癥反應，在發熱和肝臟急性炎癥反應中幾乎起著的作用，它在從急性炎癥到獲得性免疫或者慢性炎性疾病的轉化中也發揮重要作用。IL-6失調可促進慢性炎癥，如肥胖、胰島素抵抗、炎癥性腸道疾病、炎性關節炎以及敗血癥，往往涉及IL-6的反式信號轉導。在轉化生長因子TGF-β存在的情況下，IL-6在幼稚型T細胞相Th17炎性細胞分化的過程中起重要作用。IL-6調節骨吸收，通過促進Th17炎性細胞的活性，是類風濕性關節炎中造成炎性關節損傷的主要因素。IL-6參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和非穩定性。然而，IL-6也有抗炎癥作用，如體育鍛煉時骨骼肌分泌IL-6，它作為造血干細胞的生長因子促進造血、誘導B細胞成熟為漿細胞、多發性骨髓瘤細胞的永生。IL-6也促進，但可能不會啟動其它炎癥相關的癌癥發生，如結腸炎相關癌癥。

Mouse

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

1. 請在試劑盒有效期內使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養基。
4. 檢測結果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。