CLMF p35, Cytotoxic lymphocyte maturation factor 35 kDa subunit, IL12 p70, IL-12 p70, IL-12 subunit p35, IL-12, subunit p35, interleukin 12, p35, interleukin 12A (natural killer cell stimulatory factor 1, cytotoxic lymphocytematuration factor 1, p35), interleukin-12 alpha chain, interleukin-12 subunit alpha, natural killer cell stimulatory factor 1, 35 kD subunit, NF cell stimulatory factor chain 1, NK cell stimulatory factor chain 1, NKSF1, p35

Mouse IL-12 p70 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗小鼠IL-12 p70抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和生wu素化的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)孵育，樣本中存在的IL-12 p70與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)（參考校正波長(zhǎng)540nm或570nm）測(cè)定吸光度值。

Mouse

39.06pg/mL-2500pg/mL

需自備試驗(yàn)器材
1. 酶標(biāo)儀（可測(cè)量450nm檢測(cè)波長(zhǎng)的吸收值及540nm或570nm校正波長(zhǎng)的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 樣品收集及儲(chǔ)存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過(guò)離心去除；立刻檢測(cè)樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占獫{，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請(qǐng)將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測(cè)）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實(shí)際操作時(shí)可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計(jì)算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測(cè)抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計(jì)算所需體積。例：使用了10個(gè)孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測(cè)抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個(gè)孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2500pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個(gè)稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒(méi)有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（2500pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請(qǐng)立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí);
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會(huì)有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請(qǐng)將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
6. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL檢測(cè)抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí)；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請(qǐng)輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。如果沒(méi)有使用雙波長(zhǎng)校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響；
13. 計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對(duì)數(shù)與相應(yīng)OD值對(duì)數(shù)生成曲線，并通過(guò)回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過(guò)程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過(guò)稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗(yàn)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的小鼠IL-12 p70，測(cè)定其回收率。回收率范圍在83-107%，平均回收率在93%。
2. 靈敏度：小鼠IL-12 p70的zui低可測(cè)劑量（MDD）一般小于2.24pg/mL。zui低可測(cè)值是根據(jù)20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的相對(duì)應(yīng)濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組小鼠IL-12 p70蛋白所校正。
4. 線性：4個(gè)不同的樣本中摻入高濃度的小鼠IL-12 p70，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測(cè)范圍內(nèi)，測(cè)定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測(cè)天然及重組小鼠IL-12 p70蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來(lái)檢測(cè)與小鼠IL-12 p70的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組小鼠IL-12 p70對(duì)照品中，來(lái)檢測(cè)對(duì)小鼠IL-12 p70的干擾。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。含濃度1.25ng/mL 的重組大鼠 IL-12 p70 有交叉反應(yīng)性。


四、常見(jiàn)問(wèn)題解析
1. 白板（顯色完成后，無(wú)顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽(yáng)性對(duì)照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實(shí)驗(yàn)流程圖

白細(xì)胞介素12（IL-12，也稱NKSF），是70-75kDa的異源二聚體糖蛋白，屬于IL-12異源二聚體細(xì)胞因子家族。IL-12由35kDa（p35）和40kDa（p40）的兩個(gè)亞基構(gòu)成，這兩個(gè)亞基由二硫鍵相連，相互間無(wú)氨基酸序列同源性。成熟的p35亞基有196個(gè)氨基酸，包含七個(gè)半胱氨suan及一個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。成熟的小鼠p35與人和大鼠的氨基酸同源性分別為63%和86%。成熟的小鼠p40亞基長(zhǎng)313個(gè)氨基酸，包括13個(gè)半胱氨suan和5個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。有研究報(bào)道p40序列具有多態(tài)性，但這個(gè)IL-12 p70試劑盒不識(shí)別這些等位基因產(chǎn)物。
成熟的小鼠p40和人及大鼠的氨基酸同源性分別為72%和93%。雖然p35類似于促紅細(xì)胞生成素的配體，但p40更類似促紅細(xì)胞生成素受體的N-端，有WSXWS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和四個(gè)保守的半胱氨suan。這表明IL-12可能是細(xì)胞因子受體模擬物，類似于IL-6/可溶性IL-6R復(fù)合物。值得注意的是p40可以以單體或同源二聚體形式存在，而p35卻從來(lái)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單體形式。p40是白介素23（IL-23）兩個(gè)亞基中較大的亞基。雖然IL-12一直被認(rèn)為是一種分泌型分子，人們?cè)谌撕托∈蠹?xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了膜結(jié)合型IL-12。產(chǎn)生IL-12的細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、類漿樹(shù)突狀細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、CD8+DC（僅小鼠細(xì)胞）和非生發(fā)中心的（CD38-CD44+）B細(xì)胞（僅人體細(xì)胞）。
小鼠IL-12的高親和力受體是由至少2個(gè)I型跨膜糖蛋白組成，類似于細(xì)胞因子受體超家族成員。第一個(gè)亞基（Rβ1）為100kDa，以Kd=1nM與IL-12結(jié)合。這個(gè)受體是p40亞基的主要結(jié)合位點(diǎn)；第二個(gè)亞基（Rβ2）為130kDa，與Rβ1亞基無(wú)氨基酸同源性。這個(gè)受體是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，作為一個(gè)二硫鍵相連的p30-p40二聚體的附著點(diǎn)。如上所述，小鼠p40以單體、二聚體形式存在，或于p35結(jié)合形成IL-12，或于p19結(jié)合形成IL-23。同源二聚體p40和IL-23都可以結(jié)合IL-12R，作為不傳遞信號(hào)的拮抗劑。或者p40同源二聚體也可以與Rβ1結(jié)合，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。從功能上而言，IL-12已被證明能夠增強(qiáng)細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞和樹(shù)突狀表皮T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素。有報(bào)道表明，IL-12能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素。與IL-23和IL-27等其IL-12的家族成員一起，IL-12能促進(jìn)CD4+Th1型免疫反應(yīng)的進(jìn)展。作為感染應(yīng)答，IL-27最先分泌，促進(jìn)TH0向THR0/1過(guò)度，隨后分泌IL-12，產(chǎn)生Th1效應(yīng)細(xì)胞。與IL-18、IL-12一起產(chǎn)生把效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化Th1記憶細(xì)胞，接著這些細(xì)胞被IL-23激活。

Mouse

1. 請(qǐng)?jiān)谠噭┖杏行趦?nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號(hào)試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測(cè)；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測(cè)結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實(shí)驗(yàn)人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時(shí)間或溫度、試劑盒的儲(chǔ)存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時(shí)請(qǐng)做好眼鏡、手、面部及衣服的防護(hù)。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。