試劑盒組分

操作步驟：

一、質粒DNA轉染（以24孔板轉染為例）:

A、細胞接種:
1、轉染前一天對細胞進行轉接，每孔接種0.8-1.2×105個細胞，使轉染時細胞密度為90%左右，且生長良好（非常重要）；
2、最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養不足導致細胞死亡。
B、試劑B /DNA轉染復合物制備(該步完成后應立即進行轉染):
1、在1.5 mL無菌離心管中加入30 uL Trans buffer S，再加入適量的轉染試劑，見附表。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。
2、在1.5 mL無菌離心管中加入30 uL Trans buffer S，并加入適量的試劑A，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見附表。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。
3、 將DNA-Trans buffer S混合物滴加至試劑B-Trans buffer S混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15分鐘，立即轉染。注意： 試劑B-Trans buffer S混合物和DNA-Trans buffer S混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。
注意：離心管最好使用聚丙烯離心管。
C、轉染:
1、將步驟B制備的轉染復合物滴加至培養基中，邊加邊輕輕晃動培養板以使復合物均勻分布。加完后，立即將培養板轉入培養箱繼續培養。
2、培養12小時后即可觀察，最佳觀察或收獲時間為24-48小時。
3、試劑B在wan全培養基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養基。

二、siRNA轉染（以24孔板轉染為例）:

A、 細胞接種:
1、轉染前一天對細胞進行轉接，使轉染時細胞密度為30-50%左右，且生長良好、無支原體污染（非常重要）；
2、 最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養不足導致細胞死亡。
B、試劑B /siRNA轉染復合物制備 (該步完成后應立即轉染):
1、 在1.5 mL無菌離心管中加入30 uL Trans buffer S，并添加適量的轉染試劑(見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。
2、 在1.5 mL無菌離心管中加入30 uL Trans buffer S，并添加適量的siRNA（見下表），用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。
3、將siRNA-Trans buffer S混合物滴加至試劑B-Trans buffer S混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15分鐘后，立即轉染。
C、轉染:
1、將步驟B制備的轉染復合物滴加至培養基中，邊加邊輕輕晃動培養板。加完后，立即將培養板轉入培養箱繼續培養。
2、37°C培養24-72小時，檢測基因抑制效果。如果需要，細胞培養4-6小時可以更換培養基，但不是必須。
3、 試劑B 在wan全培養基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養基。

附表 1：質粒轉染不同培養體系推薦初始轉染條件

附表 2：siRNA 轉染不同培養體系推薦初始轉染條件

1、shou次轉染，請務必進行優化實驗，如24孔板質粒轉染，每孔質粒用量0.8 ug， 試劑B 可選擇2.0 uL、2.5 uL、3.0 uL、3.5 uL進行優化。24孔板siRNA轉染，試劑B 用量2.0 uL，siRNA用量可選10 pmol、20 pmol、30 pmol、40 pmol進行優化。
2、進行質粒轉染，接種細胞的數量應以確保轉染時的細胞匯合度在80-90%為準，過高或過低均會影響轉染效率。進行siRNA轉染，接種細胞的數量應以確保轉染時的細胞匯合度在30-50%為準。
3、試劑A僅用于質粒轉染，RNA或siRNA轉染不需加入試劑A。
4、 請注意質粒轉染和siRNA轉染時對細胞密度和轉染試劑用量等條件的差異，不要混用同一條件。
5、如果需要質粒穩轉，請在轉染24-48小時后加入篩選培養基。
6、 本產品適合于質粒DNA、siRNA分別獨立轉染，如需質粒DNA、siRNA共轉，請選用核酸共轉染試劑盒。
本產品僅用于科學研究，不得用于醫學臨床用途。