分子克隆（Molecular Cloning）是指將目的DNA片段（如一個基因）從復雜的基因組中“復制"出來，并將其插入到一種能夠自主復制的載體（如質粒）中，再將這個重組載體導入宿主細胞（如大腸桿菌）進行擴增和表達的過程。簡單來說，它就是一個“復制+粘貼"的過程，只不過操作對象是DNA分子。

1、分子克隆的常用方式

1.1 酶切連接

酶切連接法屬于經典的分子克隆方法，利用限制性內切酶切割目的基因DNA和載體DNA，再利用DNA連接酶連接DNA，最后轉化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實驗圓滿完成的必要條件。分子克隆技術中較常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。粘性末端，即限制性內切酶在DNA雙鏈上交錯切割，形成的核苷酸順序互補的，可形成氫鍵的末端（見圖2）；平末端，限制性內切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段（見圖3）。

圖2 EcoRI切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

愛必信擁有目前常用的如快速內切酶BsaI（abs60206）、快速內切酶AgeI（abs60338）、快速內切酶EcoRI（abs60213）、快速內切酶HindIII（abs60217）等在內的70款限制性內切酶。

?快速：5-15min內即可完成酶切；

?便捷：共用一種酶切Buffer，簡化酶切體系；

?兼容性高：在不同緩沖液中均具有較高活性；

?種類齊全：輕松應對各類酶切實驗。

核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被稱為生物界的“502"。在有Mg²⁺和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。

1.2 TOPO克隆

TOPO克隆實際是基于拓撲異構酶的克隆技術，關鍵是拓撲異構酶。該技術不需要限制性內切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產物克隆到質粒中的極其簡便快捷的方法，實現“切-粘"一步完成。

TOPO克隆特點：

1）適用于連接平末端和帶3’-A的PCR產物。

2）連接反應僅需5min。

3）陽性率高：無自連、零背景，無需藍白斑篩選，陽性克隆比例高，極少出現空載體。

表1愛必信TOPO克隆產品

1.3無縫克隆

基于重組原理的無縫克隆技術，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據 DNA 片段與線性化載體末端的 15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的 DNA 定向克隆技術。

愛必信快速多片段無縫克隆預混液（abs60619，為abs60250的升級版）特點：

?極速高效：最快5min即可完成克隆，陽性率超過95%；

?操作簡單：無需酶切連接，一步反應即可完成單/多片段組裝；

?高保真度：HiFi高保真連接酶，顯著提高成功率；

?優化升級：優化配方，穩定性更強，可耐受熱、氧等環境。

圖4 愛必信快速多片段無縫克隆預混液（abs60619）操作流程

愛必信分子克隆系列部分產品清單

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