3-10C, AMCF-I, C-X-C motif chemokine 8, CXCL8, CXCL8SCYB8, Emoctakin, GCP1, GCP-1TSG-1, IL8, IL-8, interleukin 8, K60, LAI, LECT, MDNCF, MDNCFb-ENAP, member 8, MONAPGCP1, NAP1, NAP-1NAP1, NCF, Neutrophil-activating protein 1, Protein 3-10C, T cell chemotactic factor, T-cell chemotactic factor, TCF, TSG1

Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗人IL-8抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-8與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標(biāo)儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準(zhǔn)備
1. 樣品收集及儲存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當(dāng)次試驗所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點（2000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響；
13. 計算結(jié)果：將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定優(yōu)良擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的人IL-8/CXCL8，測定其回收率?；厥章史秶?6-118%，平均回收率在108%。
2. 靈敏度：人IL-8/CXCL8的zui低可測劑量（MDD）一般小于7.8pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標(biāo)準(zhǔn)曲線零點吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計算得到的相對應(yīng)濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組人IL-8/CXCL8蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的人IL-8/CXCL8，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。
5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組人IL-8/CXCL8蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與人IL-8/CXCL8的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組人IL-8/CXCL8對照品中，來檢測對人IL-8/CXCL8的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。



四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）
2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

白細(xì)胞介素-8（IL-8，也稱GCP-1、NAP-1和CXCL8）是屬于α型或CXC家族的8-9kDa的趨化因子，可與肝素結(jié)合。目前為止，共發(fā)現(xiàn)了15種人的CXC家族蛋白，大小在8-12kDa之間。絕大多數(shù)位于人類4號染色體，都具有典型的三β折疊層/一個α螺旋結(jié)構(gòu)，多數(shù)在N端顯示Glu-Leu-Arg三肽基序。人IL-8先合成為一個99氨基酸前體，其中包含一個20氨基酸的信號序列，和一個79個氨基酸的成熟區(qū)域。它可作為單體、同源二聚體、及與CXCL4/PF4形成的異源二聚體在體內(nèi)循環(huán)。IL-8單體被認(rèn)為是zuiju有生物活性的，而異源二聚體可能會增強PF4的活性。在氨基酸水平，成熟的人IL-8與豬和犬分別有65%和70%的同源性。在嚙齒動物中，IL-8的相應(yīng)基因尚未發(fā)現(xiàn)。通過選擇性剪接和差別蛋白水解產(chǎn)生了多種IL-8亞型。選擇性剪接發(fā)生在C-端，那里有一個11個氨基酸替代（位置在aa#92-99)。蛋白酶水解作用可能是一個細(xì)胞的特定事件，它在IL-8的N-端產(chǎn)生截斷。例如，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞將第21和第22氨基酸切斷，形成IL-8，而單體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在第21-25氨基酸切割，產(chǎn)生IL-8。這些短式IL-8一般來說具有更高的生物活性，尤其是針對CXCR1IL-8受體的活性增高。大約15%的IL-8在前體Arg27位發(fā)生了瓜氨酸化，這可提高IL-8的半衰期和促使白血球增多。很多類型的細(xì)胞都分泌IL-8，其中包括單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)臟平滑肌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、II型大肺泡細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
IL-8受體有兩個，都屬于G蛋白耦聯(lián)受體蛋白：CXCR1/IL-8RA和CXCR2/IL-8RB，二者之間的氨基酸序列享有77%同源性。CXCR1分子量為45-50kDa，幾乎wan全由IL-8獨享；CXCR2分子量為35-40kDa，由所有的CXC趨化因子所共有。CXCR1和CXCR2分別形成組成型同源二聚體，這似乎是它們的功能性構(gòu)型。當(dāng)同一個細(xì)胞表達(dá)時，異源二聚體也會形成；但當(dāng)它與IL-8結(jié)合后便會被解體。CXCR2對低濃度IL-8有響應(yīng)，且主要與趨化和MMP-9釋放有關(guān)。與此相反，CXCR1對高濃度IL-8有響應(yīng)，并與呼吸爆發(fā)及磷脂酶D2的激活有關(guān)。因此，在中性粒細(xì)胞CXCR2被認(rèn)為可引導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位，然后引發(fā)CXCR1介導(dǎo)的抗菌活性。
IL-8最著名的功能是它在免疫細(xì)胞中的促炎作用。從本質(zhì)上講，IL-8是由暴露于炎性刺激因子的多種細(xì)胞類型分泌。對于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞來說，微生物的暴露引起IL-8的釋放；隨后，CXCR2介導(dǎo)的趨化作用將中性粒細(xì)胞遷移到抗原攻擊的部位，并伴隨下一步抗菌活性的激活及啟動。IL-8可增強骨髓M-CSF的作用，從而引起粒細(xì)胞的成熟和釋放。IL-8的這兩個功能相輔相成。有報道說，IL-8對腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞具有血管生成功能。此時，腫瘤源性的IL-8可以采取一種旁分泌方式激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的CXCR1和CXCR2。CXCR1和CXCR2都與PI3-K/Akt和RasGTP信號通路相關(guān)，參與細(xì)胞的存活和增殖。此外，IL-8正調(diào)節(jié)VEGFR2和EGFR屬于介導(dǎo)細(xì)胞生長和遷移的受體絡(luò)氨酸激酶。

Human

未開封試劑盒，2-8℃儲存。

1. 請在Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit有效期內(nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。