溶液

 1、細胞樣品的準備：
（1）對于貼壁細胞，在六孔板或其它多孔板內或蓋玻片上培養細胞至 50%-80%滿。細胞培養過滿會導致很難判斷是否存在支原體污染。
（2）對于懸浮細胞，離心沉淀細胞，取少量細胞做細胞涂片，空氣中充分晾干。
2、用 PBS 按照 1:10 稀釋 Hoechst 染色液(1 體積 Hoechst 染色液加入 9 體積 PBS)。稀釋后的 Hoechst 染色液宜在 24h 內使用。
3、加適量固定液固定 10~20min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對細胞進 行洗滌。對于貼壁細胞，固定前需去除培養液。
4、去除固定液，空氣中晾干。
5、加適量 10 倍稀釋的 Hoechst 染色液室溫染色 10~30min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時注意避光?？梢杂娩X箔紙避光。
6、去除染色液，空氣中晾干。
7、滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍色熒光。 熒光顯微鏡觀察時需 400 倍或 1000 倍放大觀察(需使用油鏡)。 沒有支原體污染或其它原核生物污染的細胞樣品，僅觀察到細胞核的藍色熒光，線粒體 DNA 不會被染色。
有支原體污染的細胞樣品可觀察到細胞核周圍微粒狀或絲狀藍色熒光。 支原體污染嚴重的細胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍色熒光。
有細菌、酵母或霉菌污染的情況雖然 Hoechst 染色也會呈陽性，但細菌、酵母或霉菌污染在 光學顯微鏡下可以觀察到，而支原體觀察不到，由此可以初步區分是支原體還是其它微生物。
如有必要進一步鑒定，可以通過把支原體接種培養和 RT-PCR 等方法進行進一步檢測。

1、Hoechst染色液為DMSO溶液，4℃時會凝固為固態，可室溫或37度烘箱融化后使用。
2、Hoechst 染色試劑對人體有害，請注意適當防護。
3、固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，宜在通風櫥內進行固定操作。
4、熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。
5、檢測支原體前最好用不含抗生素的培養液培養 2~3 代，這樣更容易檢測出支原體，因為一些抗生素可以抑制支原體生長。

2~8℃避光保存，有效期12個月。