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Rat IL-1 beta/IL-1F2 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測技術。特異性抗大鼠IL-1beta/IL-1F2抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經過孵育，樣本中存在的IL-1beta/IL-1F2與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Rat

62.5pg/mL-4000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品收集及儲存
①細胞培養上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據樣本稀釋倍數，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為4000pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（4000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。



二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變為黃色。如果溶液顏色變為綠色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
注：提供的標準曲線數據僅供參考，應根據同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數
1. 回收率：在細胞培養基樣本中摻入不同水平的Rat IL-1β/IL-1F2，測定其回收率。回收率范圍在82-110%，平均回收率在94%。
2. 靈敏度：Rat IL-1β/IL-1F2的zui低可測劑量（MDD）一般小于1.8pg/mL。zui低可測值是根據20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Rat IL-1β/IL-1F2，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內，測定其線性。
4. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Rat IL-1β/IL-1F2蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配置成50ng/mL的濃度來檢測與大鼠IL-1β的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組大鼠IL-1β對照品中，來檢測對大鼠IL-1β的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。

四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

白細胞介素-1（IL-1）蛋白家族成員中包括經典的IL-1和IL-1。IL-1受體拮抗劑（IL-1RA）、IL-18、IL-33、IL-1F5-F10、IL-1和IL-1有相同的細胞表面結合受體，形式相同的生物學功能。健康人未刺激的細胞是不產生IL-1的，只有皮膚角質形成細胞、一些上皮細胞，以及中樞神經系統的某些細胞是例外。但在響應炎癥因子、感染、或微生物內毒素時，IL-1在巨噬細胞和其他類型細胞表達急劇增加。IL-1在免疫和炎癥應答、骨重塑、發熱、碳水化合物代謝、GH/IGF-1的生理過程中起重要作用。多種疾病與IL-1表達失調或延時表達相關，其中包括敗血癥、類風濕關節炎、炎性腸道疾病、急性和慢性髓細胞白血病、胰島素依賴型糖尿病、動脈粥狀硬化、神經損傷和老年退化有關的疾病。
IL-1和IL-1是結構相關的多肽，在氨基酸水平約有25%的同源性。兩者都是先合成為31kDa前體，然后裂解為大約17.5kDa的成熟蛋白。由Caspase-1/ICE對IL-1的前體切割是炎癥反應的關鍵步驟。盡管IL-1和IL-1都不含有一個典型的疏水信號肽，但有證據表明，它們可以經非經典途徑分泌到胞外。未處理的IL-1部分可在細胞膜上展示，并可能保留生物活性。與IL-1前體不同，IL-1前體與成熟的IL-1相比，具有很少或根本不具有生物活性。IL-1前體與成熟的IL-1都運至胞外。
IL-1和IL-1通過免疫球蛋白超家族受體與IL-1RA結合發揮其效應。80kDa的I型跨膜受體（IL-1RI）在多種細胞中表達，包括T細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、內皮細胞、滑膜襯里細胞、軟骨細胞和肝細胞。68kDa的II型跨膜受體（IL-1RII）在B細胞、中性粒細胞和骨髓細胞中表達。IL-1RI和IL-1RII的胞外區域享有28%的同源性。但其他區域有顯著不同：II型受體的胞內域只有29個氨基酸，而I型受體的胞內域有213個氨基酸。IL-1RII似乎對IL-1信號沒有響應，其功能是作為誘騙受體從而削弱IL-1的作用。IL-1受體配體蛋白（IL-1RAcP）與IL-1RI相互作用是IL-1RI信號傳導所必需的。IL-1RA是分泌型分子，是IL-1的競爭性抑制劑。可溶性IL-1RI和IL-1RII存在于人的血漿、關節液、及幾種細胞株的條件培養基中。此外，牛痘病毒編碼類似于可溶性IL-1RII的IL-1結合蛋白。

Rat

未開封試劑盒，2-8℃儲存。

1. 請在試劑盒有效期內使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養基。
4. 檢測結果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。